طراحی و ساخت سازه های پلاسمیدی مختص انتقال هدفمند ژن به ژنوم کلروپلاستی

الحاق ژن خارجی در ژنوم کلروپلاستی از طریق نوترکیبی همتا بین توالی های مجاور آن ژن در حامل های کلروپلاستی، رخ می دهد. از آنجایی که شباهت صد در صدی توالی هدف گیری کننده کارایی تراریختی پلاستوم را به طور چشمگیری افزایش خواهد داد، یک جفت پرایمر برای جداسازی این ناحیه طوری طراحی گردید که دارای شباهت صد در صدی در تمامی پلاستوم های گیاهی باشد، ولی طول و توالی ناحیه تکثیری در ژنوم های مختلف متفاوت بود. توالی هدف گیری کننده، از پلاستوم های توتون، پنبه، ذرت، کاهو، گوجه فرنگی، هویج و حتی کلزا و لیموترش که پلاستوم آنها هنوز توالی یابی نشده است، جداسازی و کلون سازی گردید. حضور و جهت ناحیه جداشده از پلاستوم گیاهان مختلف و صحت کلون سازی، توسط آنزیم های مختلف و از جمله hindiii و bamhi مورد تایید قرار گرفت. سپس با افزودن نواحی تنظیمی مختلف شامل پیشبرها و پایانبرهای دائمی کلروپلاستی و القایی، نواحی بدون ترجمه یا utrهای مناسب، نواحی اتصال ریبوزوم پلاستیدی، جایگاه های آنزیمی مناسب ورود ژن برای بیان انفرادی و یا پلی سیسترونی، ژن های گزارشگر، ژن های نشانگر انتخابی آنتی بیوتیکی و غیرآنتی بیوتیکی و توالی هایی برای حذف ژن نشانگر پس از انتقال ژن، تلاش شد تا انواع مختلفی از حامل های کلروپلاستی ساخته شوند تا بتوان بیان هر ژن خارجی را به طور دلخواه در ژنوم های پلاستیدی گیاهان مختلف به صورت کارآمد امکان پذیر نمود که سازه های کلروپلاستی pfngi، pfng از جمله آنها بود. این پلاسمیدهای نوترکیب می توانند به عنوان حامل های پلاستیدی عمومی و اختصاصی برای انتقال ژن به کلروپلاست استفاده شوند. در این تحقیق نه تنها برای گیاهان مذکور، بلکه برای هر گونه گیاهی دیگری که توالی پلاستومی آن در دسترس نیست نیز حامل پلاستیدی اختصاصی و دارای کارایی بالا تهیه شد.